核酸的定量
核酸的定量是分光光度计频率的函数。它可以定量溶解在缓冲液中的寡核苷酸、单链DNA、双链DNA和RNA。核酸的* * *吸收峰的吸收波长为260 nm。每个核酸的分子组成不一样，所以它的换算系数也不一样。为了定量不同类型的核酸，应该预先选择相应的系数。例如，10d的吸收值相当于50μg/ml的dsDNA、37μg/ml的ssDNA、40μg/ml的RNA和30μg/ml的Olig。测试结束后，将吸光度值通过上述系数进行换算，得到相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入储备溶液和稀释液的体积，然后测试空白溶液和样品溶液。然而， 实验并不是一帆风顺的。读数不稳定可能是实验者的问题。仪器的灵敏度越高，吸收值的偏移越大。
其实分光光度计的设计原理和工作原理是允许光吸收值在一定范围内变化的，也就是仪器有一定的精度和* * *度。例如，Eppendorf生物光度计的准确度≤1.0%(1A)。这些测试的结果平均在1.0%之间变化是正常的。此外，还需要考虑核酸本身的理化性质以及溶解核酸的缓冲溶液的pH值和离子浓度:当离子浓度过高时，读数会发生漂移，如TE，可以大大稳定读数。样品的稀释浓度也是一个不可忽视的因素:因为样品中不可避免的存在一些小颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在会干扰测试结果。为了* * *减少颗粒对测试结果的影响， 要求核酸的吸光度值至少大于0.1A，吸光度值* * *在0.1-1.5a之间..在这个范围内，混合溶液中不能有气泡，空白溶液中不能有悬浮物，否则读数会急剧漂移；空白溶液和样品必须用同一比色皿测试，否则浓度差太大；换算系数与样品浓度单位的选择一致；窗口磨损的比色杯不能使用；样品的体积必须达到比色杯和其他操作事项所要求的* * *小体积。
除了核酸的浓度，分光光度计还显示了几个非常重要的比值，表示样品的纯度，比如A260/A280的比值，用来评价样品的纯度，因为蛋白质的吸收峰在280nm。纯样本，比值大于1.8(DNA)或2.0(RNA)。如果该比值低于1.8或2.0，则表明蛋白质或酚类的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、肽、酚等。相对纯的核酸的A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的浊度和其他干扰因素。对于纯样品，A320一般为0。
蛋白质的直接定量(紫外法)
这种方法是在280nm波长下直接检测蛋白质。选择Warburg公式，光度计可以直接显示样品的浓度，或者选择相应的换算方法将吸光度值换算成样品的浓度。蛋白质测定过程很简单，先测试空白溶液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中有一些杂质，一般需要消除320nm的“背景”信息，将此功能设置为“开”。与测试核酸类似，要求A280的吸光度至少大于0.1A，而* * *的线性范围在1.0-1.5之间。实验中选用Warburg公式表示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是正常现象。事实上，只要A280的吸光度值的变化范围不超过1%， 说明结果很稳定。漂移的原因是沃伯格公式的吸收值换算成浓度，乘以一定的系数。只要吸收值稍有变化，浓度就会被放大，导致结果非常不稳定。蛋白质直接定量法适用于检测相对纯净、成分单一的蛋白质。与比色法相比，紫外直接定量法快速、操作简单。但是容易被平行物质干扰，比如DNA此外，灵敏度低，并且要求蛋白质的浓度高。
比色蛋白质定量
蛋白质通常是蛋白质的混合物。比色测定是基于蛋白质组分:氨基酸(如酪氨酸和丝氨酸)与额外的生色基团或染料反应产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应中氨基酸的数量直接相关，从而反映出蛋白质的浓度。
比色法
一般来说，有几种方法，如BCA，布拉德福和劳里。
Lowry法:基于早期* * * *的缩二脲反应，并加以改进。蛋白质与Cu2反应生成蓝色反应物。但与缩二脲相比，劳里法更敏感。缺点是需要依次加入几种不同的试剂；反应需要很长时间；易受非蛋白质物质影响；含有EDTA、Triton x-100、硫酸铵等物质的蛋白质不适合这种方法。
BCA(Bicinchoninine acid assay)法:这是一种相对较新且更敏感的蛋白质测试方法。待分析的蛋白质在碱性溶液中与Cu2反应生成Cu，Cu与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰位于562nm。这种化合物与蛋白质浓度的线性关系很强，反应后形成的化合物非常稳定。与Lowry法相比，该方法简单、灵敏。但与Lowry法相似，易受蛋白质和洗涤剂的干扰。
Bradford法:该方法的原理是蛋白质与考马斯亮蓝反应，有色化合物的吸收峰为595nm。它的* * *特点是灵敏度好，比洛瑞和BCA高一倍。操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；该化合物可稳定1小时，便于结果；它还与一系列干扰劳里和BCA反应的还原剂(如DTT、巯基乙醇)相容。但对洗涤剂还是比较敏感。* * *主要缺点是不同的标准会导致同一样本的结果差异很大，没有可比性。
一些第一次接触色度学的研究人员可能会因为各种色度学方法得出的结果不一致而感到困惑。他们应该相信哪种方法？由于各种方法的反应基团和显色基团不同，同时使用几种方法得到的样品浓度是不可比的。例如，凯勒等人对人乳中的蛋白质进行了检测，结果显示洛瑞和BCA的浓度明显高于布拉德福德，差异显著。即使测定同一个样品，用同样的比色法选取的标准样品也不一致，测试后的浓度也不一致。例如，Lowry检测细胞匀浆中的蛋白质，以BSA为标准，浓度为1.34mg/ml，以球蛋白A为标准，浓度为2.64mg/ml。因此，在选择比色法之前， * * *指待测样品的化学成分，寻找与标准品化学成分相似的标准蛋白。另外，用比色法定量蛋白质时，常见的问题是样品的吸光度过低，导致测得的样品浓度与实际浓度差距较大。关键问题是反应后1011分光光度计的重要附件比色皿的颜色有一定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有样品(包括标准样品)都必须在此时间内进行测试。如果时间过长，吸收值会变小，转换后的浓度值会降低。此外，反应温度和溶液的PH值都是影响实验的重要原因。此外，非常重要的是，* * *是一种使用塑料的比色法。避免使用应时或玻璃比色皿，因为反应后的颜色会使应时或玻璃变色，导致样品的吸光度不准确。
细菌细胞密度(OD 600)
实验室确定细菌的生长密度和生长期，根据经验和目测推断细菌的生长密度。当遇到要求苛刻的实验时，需要用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是跟踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以不含菌液的培养液为空白液，然后对培养的含菌培养液进行定量。为了确保正确操作，有必要使用显微镜对每种微生物和每种仪器进行细胞计数，并制作校准曲线。实验中偶尔会出现菌液OD值为负的情况，因为使用的是有色培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基发生反应而变色。此外，应该注意的是，测试样品不能被离心， 细菌保持悬浮状态。
分光光度计的重要附件——比色杯
比色杯根据材质大致分为应时杯、玻璃杯和塑料杯。根据测量体积不同，有比色杯和毛细管比色杯。一般用应时杯或玻璃来检验核酸和紫外定量蛋白质，不适于比色测定。因为反应中的染料(如考马斯亮蓝)会使应时和玻璃染色，所以必须使用一次性塑料杯。塑料杯一般不适合测试紫外线范围内的样品。
由于测试的样品不同，一般分光光度计厂家都会提供不同容积的比色杯，以满足用户的不同需求。市场上已经有一种塑料杯，可以用于核酸和紫外蛋白的测定，也可以用于蛋白比色法的测定。样品用量仅为50μl，比色皿无菌包装，样品可回收。如Eppendorf UVettereg塑料比色皿是比色皿市场的一项创新。随着生命科学及相关学科的发展，对此类科学的实验研究提出了更高的要求。分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器，也是微生物、食品、制药等相关实验室的必备设备之一。
随着科学技术的发展，使用分光光度计时，比色皿不再是必需的。国外Nanodrop公司生产的ND1000分光光度计(现已被赛默飞世尔公司收购)与老式分光光度计相比，每次测量只需1-2μl样品即可完成测量，无需稀释样品和使用比色皿。
