免疫封闭的重要性及如何选择合适的封闭剂

在免疫测定中，自由表面必须是封闭的。这对于许多方法是正确的，例如ELISA、蛋白质阵列、免疫PCR、蛋白质印迹或免疫组织化学。

优化后蛋白质或抗体可以有效地附着在酶标板或Westernblotting膜的表面。这样，可以在具有高密度捕获抗体或捕获分子的表面上进行最佳分析。

这种优化的结果是，许多其他蛋白质或多肽可以附着在表面上。这种连接是可逆的。如果不密封表面，样品中的分析抗体、示踪剂、分析物或其他成分将会结合到表面上。这可能会导致错误的结果或高背景信号。即使没有分析物，直接连接到酶标板孔上的检测抗体也会产生信号。这必须停止。为了使每个表面的自由结合能力饱和，有必要将其密封。饱和是通过用致密分子层覆盖表面以使该层没有间隙来实现的。

ELISA板包被捕获抗体(或抗原)后，表面的游离结合位点必须关闭。密封溶液含有高浓度的密封剂。孵化在微孔中进行。这导致封闭剂吸附到表面上的自由结合位点。理想情况下，产生完全致密且无间隙的层。孵育时间取决于封闭剂，并且可以非常短(如果使用非常好的封闭剂)。一般来说，建议使用较长的孵育时间，选择合适的操作步骤。孵化时间通常为1-2小时或过夜。

密封后可继续进行后续测定。除了密封步骤之外，建议使用LiquidPlateSealer来稳定封闭的板。这可以提高捕获抗体与分析物的结合能力，并且可以在灵敏度和可重复性方面提高一些测定的结果。此外，未使用的包被酶标板可以储存更长时间。稳定剂与封闭剂一起在ELISA板的孔中孵育。LiquidPlateSealer在捕获的抗体或包被的抗原上覆盖一层易于溶解的保护层。

这一层有两个功能。首先，这一层可以直接改善许多捕获的抗体或抗原的结构构象。在孵育和随后的ELISA板干燥过程中发生构象改善。与未处理的捕获抗体相比，此时的捕获抗体具有更高的结合能力。当酶标板干燥后，其效果与包被的捕获分子有关，可直接测量。第二个功能是包被的生物分子的长期稳定性。稳定后，酶标板可在4℃下长期保存。在大多数情况下，可以通过涂覆和储存许多板来简化实验室的操作程序。稳定化也可用于降低ELISA突变的效率。LiquidPlateSealer的积极效果很大程度上取决于所用的生物材料(如抗体和抗原)。因此， 通常不可能基于单次检测来量化积极效果。

没有能适用于各种测定的完美封闭剂。封闭剂必须与相应的检测方法相匹配，对于任何新的检测方法都必须单独选择。对于针对蛋白质或肽结合而优化的平板和蛋白质印迹膜，基于蛋白质的封闭剂比其他封闭剂更有效。在大多数情况下，合成封闭剂的效率低于基于蛋白质或多肽的效率。

BSA-Block是基于BSA的经典封闭剂。牛血清白蛋白是最重要的蛋白质之一，具有良好的纯度和适量，可用于研究和应用。因此，它长期以来被用作免疫测定中的封闭剂。在使用的许多测定方法中，它有可靠的验证记录。BSA-Block产品是由经过认证的公司从纯化的BSA中生产的。像所有基于BSA的解决方案一样，密封效果不是最佳的。BSA是一种蛋白质，体积太大，无法构建一个密度最好的层。但是对于大多数分析来说，这是可以接受的，对于一些分析来说，BSA是最好的封闭剂。一些抗体仅在BSA存在下显示出最佳结合效率。有些抗体可以包被为包被抗体，然后用BSA封闭，效果最好。对于某些抗体来说，BSA-Block比任何其他封闭剂都显示出更好的结果， 因为它对捕获抗体有直接的积极作用。结合随后与作为包被抗体稳定剂的LiquidPlateSealer一起孵育，可以显著提高BSA对抗体的正效应。与合成封闭剂相比，BSA具有优异的封闭效果，但低于新型封闭剂。

为了获得良好的产品性能、可重复性和经济性，开发了许多检测方法。对于这种检测，CANDOR开发了一种基于肽的封闭剂SmartBlock。批次之间的一致性相当于合成密封胶的高一致性。作为一种基于肽的封闭剂，SmartBlock可以很好地结合表面，也可以结合抗体或蛋白质。此外，肽的化学优化增强了在蛋白质结合表面上的结合。因此，与许多其他密封剂相比，它的密封效果更好。然而，它是一种经济的产品，也可用于生产蛋白质印迹和ELISA试剂盒。SmartBlock是免疫分析和应用中最有效的封闭剂。

多年来，酪蛋白在文献中被描述为合适的封闭蛋白。酪蛋白的封闭效率通常优于BSA。酪蛋白提供了许多商业上可获得的阻断剂。在生产过程中，通常将酪蛋白溶解，过滤除去不溶成分。CANDOR提供酪蛋白基封闭剂-TheBlockingsolution。但是，这种密封剂不能与其他制造商提供的常规酪蛋白密封剂相比。CANDOR开发的专利生产工艺对高纯度酪蛋白进行了化学改性。在生产过程中，改性酪蛋白被打碎。结果，获得了具有宽且一致的光谱范围的不同大小片段的改性酪蛋白溶液。虽然制作过程比较困难，但是批次之间的一致性还是很好的。每批封闭溶液的测定结果相同。因此， 允许在GLP实验室中常规使用，或在具有极低检测限的现代诊断产品中使用，如现代生物标志物的诊断。独特的生产技术带来极其有效的特性密封剂。

与BSA等替代封闭剂相比，该试剂极高的封闭效果可通过测量变异系数(cv)轻松量化。通常，并不是每次测定都需要极高功效的封闭溶液。我们建议封闭解决方案用于需要准确、可靠和可重现的分析物定量分析的关键应用，以及稀有和珍贵样品的分析。

我们建议您不要使用每批成分差异很大或可能被污染的封闭剂。有了这种封闭剂，你可以观察变化的结果或取决于不同的批次背景。这种封闭剂的使用不适用于GLP实验室和其他标准化区域或人类诊断试剂盒的生产。在这些地区，不允许改变纯度，这将意味着每批产品的广泛验证。

这些不当封闭剂包括奶粉基封闭剂和一些市售封闭剂，如鱼基提取物和许多其他动物基提取物。至于奶粉，需要提到的是，奶粉只是食品，不是实验室使用的化学品。奶粉可能是最便宜的密封剂，但只有在污染导致的结果可变或不明确的情况下才使用。奶粉作为一种廉价的封闭剂，应该合理使用，用于一些研究领域的测定，也可以用于大学的教学实验。

总之，每种检测方法都需要寻找和找到合适的封闭剂。在选择合适的封闭剂之前，必须明确测定质量或结果质量的重要性。如果是珍贵的样品或者需要可靠的结果(比如法规要求)，一定要注意密封效率高。如果对结果质量要求不高，也可以使用简单的封闭剂。如大学或学院的教学培训分析，奶粉待遇没有问题。