微生物限度检查法(薄膜过滤法)
验证方案
微生物限度检查法(薄膜过滤法)验证方案
代码:表
一、核查方案的起草和批准
1.验证方案草案
起草人:起草期:年月日
2.验证团队成员:
3.验证方案审计
4.验证方案批准
批准人:批准日期:
二、验证方案
1.验证的目的和原则
1.1验证目的
为了确认所采用的方法适用于该药品中细菌、霉菌和酵母菌的测定，特制定本方案。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，因特殊原因确需变更的，应报验证委员会批准。
1.2原则
通过比较四组试验菌的恢复生长结果，评价整个试验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤
2.1验证前的准备:微生物限度检查法(薄膜过滤法)验证前，应对所有平板和稀释剂进行严格检查。
按照相关灭菌程序进行消毒，确保不影响检测结果。测试细菌应包括G-、G+、酵母和霉菌微生物，以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
2.2验证试验操作方案:用不同批次产品的三种微生物限度检查方法进行平行试验，通过计算回收率判断限度检查方法是否对产品有影响。
2.3试验结果的可接受标准:用标准菌株评价法的微生物限度检查样品中微生物的抑制情况，试验结果应显示稀释液对照组的细菌回收率不低于70%，试验组的回收率不低于70%。
3.测试实现
3.1试验前的准备
3.1.1主要仪器设备:生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境:手术室应安装空气除菌过滤层装置。环境洁净度不低于10000，局部洁净度100(或把净化工作台放在同一水平)。操作室或净化工作台的洁净空气应保持对环境的正压，不低于4.9pa
3.1.3试样:
批号:批号:批号:
3.1.4培养基:
3.1.5稀释剂:PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
上述材料经115℃高压蒸汽灭菌30分钟。
3.1.6用于验证的微生物的名称和编号。
实验菌株来源:
序列号由细菌名称、传代次数和制备日期的首字母组成。
3.1.7仪器:无菌滤膜:(孔径0.45um直径50mm)，无菌移液管(5ml)。
4.验证方法
4.1菌液的制备
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌接种于10ml无菌营养肉汤中，于30～35℃培养18～24h。将白色念珠菌接种于改良马丁液体培养基中，于23 ~ 28℃培养24 ~ 48。将黑曲霉接种于改良马丁液体培养基中，于23 ~ 28℃培养5 ~ 7天。用0.9%无菌氯化钠溶液将上述培养物制成每毫升含50 ~ 100个fu菌落的菌悬液。
4.2实验方法
试液的制备:取10g(ml)样品，加入100ml ph 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，摇匀使其分散均匀□,用均质机混匀□,置于45℃水浴中使外壳熔化并混匀□,制成1: 10的均匀试液。
样本测试组
取10ml 1:10试液(相当于1g或1ml试液)，加入100ml稀释液中，混匀，过滤，用稀释液冲洗滤膜3次，每次100ml，在*后的冲洗液中加入50~100cfu菌液，过滤后，取出带菌滤膜，菌面朝上(与细菌和样品接触的面)贴在固化的培养基上。将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌附着在营养琼脂培养基平板上；白色念珠菌和黑曲霉附着在玫瑰钠琼脂培养基平板上。
b菌液群
将上述菌液各1ml加入100ml稀释液中，混匀，过滤，用稀释液冲洗滤膜三次，每次100ml。过滤后，取出带有细菌的滤膜，细菌面朝上(接触细菌和样品的一面)贴在固化的培养基上。将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌附着在营养琼脂培养基平板上；白色念珠菌和黑曲霉附着在玫瑰钠琼脂培养基平板上。
c测试样品对照组
取上述1: 10试液10ml，加入100ml稀释液中，混匀，过滤，用稀释液冲洗滤膜3次，每次100ml，过滤后取出滤膜，贴在已凝固的培养基上，接触样品的面朝上。将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌附着在营养琼脂培养基平板上；白色念珠菌和黑曲霉附着在玫瑰钠琼脂培养基平板上。
d稀释剂对照组
用PH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲溶液冲洗滤膜三次，每次100ml，最后一次冲洗液中加入50~100cfu菌液，过滤后取出带菌滤膜，将菌面贴在固化的培养基上。将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌附着在营养琼脂培养基平板上；白色念珠菌和黑曲霉附着在玫瑰钠琼脂培养基平板上。
4.3文化
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌在30 ~ 35℃培养48h，白色念珠菌和黑曲霉在23 ~ 28℃培养72h，计数菌落数。
5.试验结果
5.1产品试验组微生物生长检查:批号:
5.2对照组微生物生长检查:批号:
5.3稀释液对照组微生物生长检查:批号:
5.4菌液组微生物生长检查:批号:
6.回收率的计算
6.1稀释液对照组细菌回收率
表中:回收率=稀释液对照组平均菌落数÷菌液组平均菌落数×100%。
6.2试验组细菌回收率
表中:菌液组回收率=(试验组平均菌落数-试验对照组平均菌落数)×100%。
7.结论:
7.1经验证，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率分别为%、%、%、%和%。
7.2稀释剂的回收率为%、%、%、%。
上述验证结果证明本品采用上述方法进行微生物限度检查。
检查员:检查者:
8.验证结果的评估和分析
质量控制部负责记录验证和试验结果，验证小组对验证和试验结果进行评价，起草验证报告并提交给验证委员会。
验证委员会负责对验证结果进行综合评估，做出验证结论，并签发验证证书。验证结果的评审应包括:
(1)核实测试中是否有遗漏；
(2)验证方案在验证实施过程中是否被修改，修改的原因和依据，是否得到批准；
(3)核实记录是否完整；
(4)验证试验结果是否符合标准要求，偏差及对偏差的说明是否合理，是否需要进一步补充试验。
9.*最终批准
验证报告经验证组长审核后，提交验证总负责人批准，并签发验证证书。
验证报告
年至年，验证组根据验证组批准的验证文件，对微生物限度检查法(薄膜过滤法)进行了一系列验证工作，取得了预期的结果。现将有关事项说明如下:
1.验证方案在实施过程中未被修改。
2.验证方案的性能指标在验证过程中没有发生变化，误差在允许范围内。
3.验证过程中的结果符合规定的要求，记录完整、真实。
4.验证结果符合设计要求和GMP原则，可以投入使用。
5.当成分或检验条件发生变化时，需要重新验证。
以上情况，请你委批准核实！