微生物限度检查法(薄膜过滤法)
验证方案
微生物限度检查法(薄膜过滤法)验证方案
代码:表
一、核查方案的起草和批准
1.验证方案草案
起草人:起草期:年月日
2.验证团队成员:
3.验证方案审计
4.验证方案批准
批准人:批准日期:
二、验证方案
1.验证的目的和原则
1.1验证目的
为了确认所采用的方法适用于该药品中细菌、霉菌和酵母菌的测定，特制定本方案。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，因特殊原因确需变更的，应报验证委员会批准。
1.2原则
通过比较四组试验菌的恢复生长结果，评价整个试验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤
2.1验证前的准备:微生物限度检查法(薄膜过滤法)验证前，应对所有平板和稀释剂进行严格检查。
按照相关灭菌程序进行消毒，确保不影响检测结果。测试细菌应包括G-、G+、酵母和霉菌微生物，以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
2.2验证试验操作方案:用不同批次产品的三种微生物限度检查方法进行平行试验，通过计算回收率判断限度检查方法是否对产品有影响。
2.3试验结果的可接受标准:应使用标准菌株评价方法的微生物限度检查样品中微生物的抑制情况。试验结果应表明，稀释液对照组的细菌回收率不得低于70%，试验组的回收率不得低于70%。
3.测试实现
3.1试验前的准备
3.1.1主要仪器设备:生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境:手术室应安装空气除菌过滤层装置。环境洁净度不低于10000，局部洁净度100(或把净化工作台放在同一水平)。操作室或净化工作台的洁净空气应保持对环境的正压，不低于4.9pa
3.1.3试样:
批号:批号:批号:
3.1.4培养基:
3.1.5稀释剂:PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
上述材料经115℃高压蒸汽灭菌30分钟。
3.1.6用于验证的微生物的名称和编号。
实验菌株来源:
序列号由细菌名称、传代次数和制备日期的首字母组成。
3.1.7仪器:无菌滤膜:(孔径0.45um直径50mm)，无菌移液管(5ml)。
4.验证方法
4.1菌液的制备
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌接种于10ml无菌营养肉汤中，于30～35℃培养18～24h。将白色念珠菌接种于改良马丁液体培养基中，于23 ~ 28℃培养24 ~ 48。将黑曲霉接种于改良马丁液体培养基中，于23 ~ 28℃培养5 ~ 7天。用0.9%无菌氯化钠溶液将上述培养物制成每毫升含50 ~ 100个fu菌落的菌悬液。
4.2实验方法
试液的制备:取10g(ml)样品，加入100ml ph 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，摇匀使其分散均匀□,用均质机混匀□,置于45℃水浴中使外壳熔化并混匀□,制成1: 10的均匀试液。
样本测试组
取10ml 1:10试液(相当于1g或1ml试液)，加入100ml稀释液中，混匀，过滤，用稀释液冲洗滤膜3次，每次100ml，在*后的冲洗液中加入50~100cfu菌液，过滤后，取出带菌滤膜，菌面朝上(与细菌和样品接触的面)贴在固化的培养基上。将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌附着在营养琼脂培养基平板上；白色念珠菌和黑曲霉附着在玫瑰钠琼脂培养基平板上。
b菌液群
将上述菌液各1ml加入100ml稀释液中，混匀，过滤，用稀释液冲洗滤膜三次，每次100ml。过滤后，取出带有细菌的滤膜，细菌面朝上(接触细菌和样品的一面)贴在固化的培养基上。将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌附着在营养琼脂培养基平板上；白色念珠菌和黑曲霉附着在玫瑰钠琼脂培养基平板上。
c测试样品对照组
取上述1: 10试液10ml，加入100ml稀释液中，混匀，过滤，用稀释液冲洗滤膜3次，每次100ml，过滤后取出滤膜，贴在已凝固的培养基上，接触样品的面朝上。将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌附着在营养琼脂培养基平板上；白色念珠菌和黑曲霉附着在玫瑰钠琼脂培养基平板上。
d稀释剂对照组
用PH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲溶液冲洗滤膜三次，每次100ml，最后一次冲洗液中加入50~100cfu菌液，过滤后取出带菌滤膜，将菌面贴在固化的培养基上。将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌附着在营养琼脂培养基平板上；白色念珠菌和黑曲霉附着在玫瑰钠琼脂培养基平板上。
4.3文化
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌在30 ~ 35℃培养48h，白色念珠菌和黑曲霉在23 ~ 28℃培养72h，计数菌落数。
5.试验结果
5.1产品试验组微生物生长检查:批号:
5.2对照组微生物生长检查:批号:
5.3稀释液对照组微生物生长检查:批号:
5.4菌液组微生物生长检查:批号:
6.回收率的计算
6.1稀释液对照组细菌回收率
表中:回收率=稀释液对照组平均菌落数÷菌液组平均菌落数×100%。
6.2试验组细菌回收率
表中:菌液组回收率=(试验组平均菌落数-试验对照组平均菌落数)×100%。
7.结论:
7.1经验证，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率分别为%、%、%、%和%。
7.2稀释剂的回收率为%、%、%、%。
上述验证结果证明本品采用上述方法进行微生物限度检查。