微生物检测在理论研究和生物医学领域都具有重要意义
在合适的外界条件下，一个微生物细胞不断地吸收营养，按照自己的代谢模式进行代谢。如果同化的速度超过异化的速度，原生质的总量(重量、体积、大小)就会不断增加，于是就有了个体的成长。如果这是一种平衡生长，即当每个细胞成分以适当的比例生长时，达到一定程度后就会繁殖，从而引起个体数量的增加。这时，原来的个体已经发展成了群体。随着一个群体中每个个体的进一步成长，引起这个群体的成长，可以用它的体积、重量、密度或浓度来衡量。微生物的生长不同于其他生物的生长，微生物的个体生长在科学研究上是困难的，通常没有实际意义。微生物以数量取胜， 所以微生物的增长通常是指种群的扩大。微生物的生长繁殖是其与各种内外环境因素相互作用的综合反映。因此，生长和繁殖可以作为研究各种生理、生化和遗传问题的重要指标。同时，微生物在生产实践中的各种应用或病原性、霉变性微生物的防治都与其生长抑制密切相关。因此有必要介绍微生物生长的检测方法。由于生长意味着原生质含量的增加，所以测定方法都是以直接或间接为基础，而繁殖的测定则应以计数为基础。微生物的生长可以通过其重量、体积、密度、浓度来衡量，作为衡量的指标。
1.微生物测定法
1.1体积测量方法
又称菌丝体浓度测量法，通过测量体积培养基中所含菌丝体的量来反映微生物的生长状况。方法是:将一定量的培养液(如10 mL)放入带刻度的离心管中，设定离心时间(如5 min)和转速(如5000 rpm)，离心后倒出上清液。当测得上清液体积为V时，菌丝体浓度为(10-v)/10。菌丝体浓度的测定是大规模工业发酵生产中微生物生长的重要监控指标。这种方法广泛、简单、快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差会很大，因为离心沉淀中混有一些固体营养物，结果会有偏差。
干重法
它可以通过离心或过滤来确定。一般干重为湿重的10~20%。在离心法中，将待测体积的培养液倒入离心管中，以设定的离心时间和转速离心，用清水离心洗涤1-5次，并干燥。干燥可在105℃或100℃的烘箱中进行，或通过红外线，或通过80℃或40℃的真空干燥，然后称重。如果用过滤法，丝状真菌可以用滤纸过滤，细菌可以用醋酸纤维素膜等滤膜过滤。过滤后，用少量水洗涤，并在40℃真空干燥。叫干繁殖法很复杂。通常，当获得的微生物产物为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母、ADY)、一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。
1.3浊度法
微生物的生长导致培养物浊度增加。紫外分光光度计用于测量该波长处的光吸收值，以判断微生物的生长情况。一个带侧臂的新三角瓶可以用来定期跟踪培养物中细菌的生长。将侧臂插入光电比色计比色座的孔中，无需取菌液即可随时测定其生长情况。这种方法主要用于监控发酵工业中细菌的生长。如UN公司的紫外-可见分光光度计，通过用比色管在600 nm波长下测量吸光度值OD600，来监测大肠杆菌的生长和诱导时间。
1.4菌丝体长度测量方法
对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基中测量菌丝的生长长度，或者用一端开口、带有刻度的细玻璃管，进入合适的培养基，躺下，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录菌丝的生长长度，从而测量丝状微生物的生长情况。
2.微生物计数法
2.1血细胞计数平板法
血细胞计数板是一种具有结构尺度和厚度的厚玻璃片。载玻片上有四个凹槽和两个脊，中央有一个短的水平凹槽和两个平台。两个脊的表面比两个平台的表面高0.1毫米。每个平台上刻有不同规格的网格，中心0.1 mm2的面积上刻有400个小方块。用油镜观察，统计一个大细胞中的微生物数量，就可以算出1毫升菌液中所含的细菌数量。这种方法简单、直观、快速，但只适用于对单细胞微生物或丝状微生物产生的孢子进行计数，结果是包括死细胞在内的细菌总数。
2.2染色计数法
为了弥补某些微生物在油镜下不易观察计数，血细胞计数平板法无法直接区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。借助不同的染料，在显微镜下可以更方便地计数活菌。例如，可以用亚甲蓝染色液来计数酵母活细胞的数量。染色后，活细胞无色，死细胞蓝色。
2.3比例计数法
将颗粒浓度已知的液体(如霉菌孢子或红细胞)与待测细胞浓度的菌液按比例均匀混合，通过在显微镜视野内计数它们各自的数量，即可得到未知菌液的细胞浓度。这种计数方法比较广泛。并且有必要制备具有已知颗粒浓度的悬浮液作为标准。
2.4液体稀释法
未知细菌样本被连续稀释10倍。根据估计的数量，从三个合适的连续10倍稀释物中取出5 mL样品，并接种到1 mL至三组15个含有培养液的试管中。培养后，记录每个稀释度下生长的试管数，然后通过查MPN(最可能数)得到细菌样本中的细菌数，根据样本的稀释倍数计算活菌含量。这种方法常用于检测食品中的微生物，如饮用水和牛奶的微生物限度检查。
2.5平板菌落计数法
这是一种计数活细菌的常用方法。对待测菌液进行梯度稀释，取一定体积稀释后的菌液，在固化前与合适的固体培养基混合均匀，或将菌液涂布在固化后的固体培养基平板上。孵育后，原始细菌溶液的细菌计数可以通过将平板上出现的菌落数乘以细菌溶液的稀释度来计算。直径9 cm的平板上一般要出现50~500个菌落。但是方法比较麻烦，操作者需要熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得到菌液中的活菌数，而且可以一次分离培养菌液中的细菌，得到单克隆。
2.6试剂纸
在平板计数法的基础上，开发了用于快速计数的小型商用产品。有小而厚的滤纸片，琼脂片等。在滤纸和琼脂上吸取合适的培养基，加入活性指示剂2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，无色)浸泡试验菌液，然后在密封包装袋中培养。短期培养后，可将滤纸上玫瑰色微菌落的密度与标准纸色板上的光谱进行比较，以估计样品的细菌含量。试纸计数法快速准确，避免了平板计数法的人为操作误差。
2.7薄膜过滤法
含菌样品用专用滤膜过滤体积，橙黄染色，紫外显微镜下观察细胞荧光。活细胞会发出橙色荧光，而死细胞会发出绿色荧光。
3.间接测定法
微生物的生长伴随着一系列生理指标的变化，如pH值、含氮量、含糖量、产气量等。与生长量平行的生理指标有很多，可以作为生长测量的相对值。因此，生理指标等间接参数可以用来衡量生物量。
3.1氮含量的测定
大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%。根据含氮量×6.25，可以确定粗蛋白的含量。测定氮含量的方法有很多，如碘消化法、磷酸消化法和杜马斯法测定N2气体。杜马斯测量N2气体的方法是将样品与CuO混合，在CO2气流中加热，产生氮气，收集在呼吸计中，用KOH吸收CO2后测量N2的量。
3.2碳含量的测定
将少量(0.2~2.0 mg干重)生物材料混入1 mL水或无机缓冲液中，用2 mL 2% 2% K2Cr2O7溶液在100℃加热30分钟，然后冷却。加水稀释至5 mL，在580 nm波长处读取吸光度值，计算生长量。需要使用试剂作为空白对照，使用标准样品作为标准曲线。
还原糖测定方法
还原糖通常指单糖或寡糖，可被微生物直接利用。还原糖的测定可以间接反映微生物的生长情况，常用于大规模工业发酵生产中微生物生长的常规监测。方法是:离心，取上清液，加入费林试剂，沸水浴煮沸3分钟，取出加少许酸化，在接近终点时加入淀粉溶液，继续加入Na2S2O3至终点，查表读出还原糖含量。
3.4氨基氮的测定
离心，取上清液，加入甲基红和指示剂，加入0.02 mol/L NaOH显色至颜色刚好褪色，加入18%中性底物，反应数分钟，加入0.02 mol/L NaOH使其变色，根据NaOH用量计算氨基氮含量。根据培养基中氨基氮的含量，可以间接反映微生物的生长状况。
3.5其他生理物质的测定
P、DNA、RNA、ATP、NAM(乙酰胞壁酸)的含量和其他指标，如产酸、产气、产CO2(使用标记作为底物)、耗氧量、粘度和产热，可用于确定生长。还可以根据反应前后底物浓度、最终产气量、微生物活性的变化来反映微生物的生长情况。比如在BMP-2的发酵生产中，可以随时监测溶解氧和pH值的变化来判断细菌的生长情况。
4.商业快速微生物检测方法
微生物检测的发展方向是快速、准确、简便和自动化。目前，许多生物制品公司利用传统的微生物检测原理，结合不同的检测方法，设计出各种类型的微生物检测仪器和设备，逐渐广泛应用于医学微生物检测和科学研究中。例如:
4.1试剂盒、培养基和其他手段
抗干扰培养基与快速微生物数量检测技术的结合，解决了传统微生物检测方法无法解决的问题，为建立完整的抗干扰微生物检测系统奠定了坚实的基础。如:抗干扰微生物培养基、新型生化鉴定管、微生物计数卡、环境质量检测试剂盒等。，可方便地用于多种测试。
4.2借助新仪器
BACTOMETER的全自动细菌总数和快速细菌检测系统可在数小时内获得监测结果，样本的颜色和光学特性不影响读数。它对酵母和霉菌的检测也非常敏感。原理是通过阻抗技术将待测样品和培养基置于反应试剂盒中，底部有一对不锈钢电极，测量微生物生长引起的阻抗变化。例如，当微生物生长时，培养基中的大量营养物质可以通过代谢转化为活性小分子，这种微弱的变化可以用电阻抗法检测，这样就可以比传统的平板法更快地监测微生物的存在和数量。测定项目包括细菌总数、酵母菌、大肠杆菌、霉菌、乳酸菌、嗜热菌、 革兰氏阴性菌等。
微生物OD值是反映细菌生长状态的指标，OD是光密度的缩写，表示被检测对象吸收的光密度。通常400~700 nm是微生物测定的范围，所以需要用紫外分光光度计测量吸收波长。最常用的有:菌丝体505 nm，酵母560 nm，细菌600 nm。通过测定OD值绘制微生物生长曲线时，同一菌株的初始培养浓度可准备多个试管(根据检测点的需要，如需检测10个点，可准备10个试管)，然后从每个点取一个试管测OD值。
一般用于测量细胞密度的OD的波长范围为580 nm-660 nm，如枯草芽孢杆菌的600 nm，已经属于可见光区(200 nm-400 nm为紫外光区，400 nm-800 nm为可见光区)。如果空白是水做的，需要离心清洗；如果空白是用未接种的培养基制作的，则不需要清洗，但未接种的培养基应与接种同时培养，以达到相同的条件。之后注意OD值一般控制在0.1~0.4，这个区域的数值比较可靠。如果OD大于1.0，则应稀释并再次测量。因为OD太大，分光光度计的灵敏度会明显降低。
一般测量吸收值，整个实验过程中保持细菌稀释倍数一致就好，吸收值与稀释倍数不成正比，可以保证整个实验点的可比性。而且取值的时候要连续读，重复三遍。
另外，为什么用分光光度计测量微生物的OD值时，波长要设置为600 nm？
这个波长其实只针对浊度，分光光度计在600 nm处对浊度比较敏感。测量吸收峰实际意义不大。例如，在LB摇瓶中过夜培养的大肠杆菌实际上在400纳米以上有吸收，但那很可能是培养液的吸收峰。